Yoshiyuki Kimura,1 Tadashi Kido,3 Takeshi Takaku,2 Maho Sumiyoshi1 и Kimiye Baba3

1 Второе Отделение Клинической Биохимии, Медицинский Университет и 2 Единый Центр Наук, Отделение Shigenobu, Университет Ehime, Shigenobu-cho, Onsen-gun, Ehime 791-0295; and 3 Отделение Фармакогнозии, Университет Фармацевтических Наук Осака, Nasahara, Takatuski Сити, Осака 569-1094

(получено 10ого июня 2004г./исправлено 26ого июля 2004г./одобрено 27ого июля 2004г.)

Ранее мы выявили, что провитамин Д2 (эргостерол), выделенный из Agaricus Blazei, приостанавливает рост опухоли посредством торможения реваскуляризации, вызванной опухолью. В настоящем исследовании мы изолировали из гриба последующие противоангиогенные вещества (А-1 и А-2), используя систему анализа ангиогенеза, вызванного Matrigel и дополненного эндотелиальным фактором роста. А-1 был идентифицирован как пироглютамат натрия. Позднее мы исследовали противоопухолевое и противометастатическое воздействие А-1 на мышей, носителей карциномы легких Льюиса (КЛЛ). А-1 (30,100 и 300 мг/кг) тормозил рост опухоли и метастазирование легких. Путем орального приема А-1 (30,100 и 300 мг/кг) наблюдалось торможение уменьшения количества селезеночных лимфоцитов, Т клеток CD4+ и CD8+ у мышей, носителей КЛЛ. Далее, благодаря использованию А-1, мы наблюдали увеличение количества апоптических клеток опухолей, Т клеток CD8+, а также, природных клеток киллеров, распространившихся в опухоли. Наблюдалось притормаживание увеличения выражения фактора Willebrand (измерение ангиогенеза) в опухоли. Данные результаты позволили сделать вывод, что противоопухолевое и противометастатическое воздействие А-1 (пироглютамат натрия) может быть связано с подавлением сниженной иммунной реакции, вызванной ростом опухоли и реваскуляризации, вызванной опухолью. Это первый доклад, демонстрирующий, что пироглютамат натрия, изолированный из Agaricus Blazei, как противоангиогенное вещество обладает сильнодействующим противоопухолевым и противометастатическим, а также иммуномодулирующим действием на мышей, носителей опухоли. (Cancer Sci 2004; 95: 758–764)

В Бразилии базидиальный гриб Agaricus Blazei Murill (японское название: Himematsutake или Agarikusutake) традиционно использовался в качестве продукта лечебного питания для предотвращения рака, диабета, гиперлипидемии, артериосклероза и хронического гепатита. Официально подтверждено, что ежегодно в Японии производится от 200000 до 400000 кг сухого тела Agaricus Blazei. 1, 2) Для предотвращения рака и/или в качестве вспомогательного средства совместно с химиотерапевтическими лекарствами после удаления злокачественной опухоли, Agaricus Blazei используют от 300000 до 500000 людей. 1, 2) Обычно прописывают 3-5 граммов водного экстракта Agaricus Blazei три раза в день. Горячий водный экстракт Agaricus Blazei обладает сильным противоопухолевым воздействием на мышей, носителей саркомы 180. 3–6) Предполагается, что противоопухолевое воздействие свойственно - (1-6) глюкановой фракции. 3–6) Ранее мы исследовали противоопухолевое воздействие различных веществ, изолированных из липидной части Agaricus Blazei и идентифицировали эргостерол как активное вещество. 7) Мы обнаружили, что эргостерол тормозил реваскуляризацию, вызванную опухолью. Далее, мы обнаружили, что ацетон - растворимые фракции экстрактов этанола тормозили рост опухоли и метастаз у мышей, носителей карциномы легких Льюиса (КЛЛ), а также ангиогенез, вызванный Matrigel (неопубликованные данные). В предварительном эксперименте, в ацетон - растворимых фракциях экстрактов этанола, мы обнаружили большое количество Д-маннитола. Тем не менее, in vivo (данные не указаны) Д-маннитол не оказывает эффекта на ангиогенез, вызванный Matrigel. Поэтому мы приготовили метанол - растворимую фракцию из хлороформ - метанола (1:1, в объемном отношении) для того, чтобы удалить Д-маннитол. После этого мы попытались изолировать противоангиогенные вещества из метанол- растворимой фракции, которые проявляли противоопухолевое и противоангиогенное воздействие. С помощью метода анализа ангиогенеза, вызванного Matrigel, мы изолировали два активных вещества (А-1 и А-2) из Agaricus Blazei. Этот доклад ставит себе целью определить структуру А-1 и эффект, оказываемый А-1 на рост опухоли и метастаз легких у мышей, носителей КЛЛ. Кроме того, с целью прояснить механизм противоопухолевого и противоангиогенного воздействия А-1, мы исследовали эффект А-1 на селезеночную иммунную функцию, апоптоз опухоли и реваскуляризацию, вызванную опухолью.

Вещества и методы

Общие экспериментальные процедуры

Спектр 1H-NMR (499.8 мегагерц) и 13C-NMR (125.68 герц) были зафиксированы в D2O с помощью спектрометра Varian Unity Inova 500 (Tosoh, Токио). Масс-спектры были измерены с помощью спектрометра Hitachi M-4000 H (Токио). Тонкослойная хроматография (ТСХ), предварительная ТСХ, обращённо-фазовая колоночная хроматография и предварительная обращённо-фазная хроматография (ОФХ (RP-HPLC)) были проведены с использованием силикагеля 60 F254, силикагеля 60 PF254, силан силикагеля 60 PF254 (Merck, Германия) и колонки Shimpak PREP-ODS (20 i.d. (внутренний диаметр) 250 мм, Shimadzu, Kyoto, Япония) соответственно. Остальные химикаты были реагентами.

Природные вещества и изоляция противо-ангиогенных веществ из Agaricus Blazei

Сушеные грибные тела Agaricus Blazei были предоставлены компанией BHN Co. (Токио). Контрольные образцы находятся на хранении во Втором Отделении Клинической Биохимии, Медицинский Университет; Университете Ehime (Ehime, Япония). Сушеные грибные тела Agaricus Blazei (1кг) были напрямую получены с использованием CHCl3-MeOH (1:1) (2 литра x 3) в течение 3 часов с последующим охлаждением. Экстракт был сгущен под пониженным давлением для получения темно-коричневого экстракта (250 г). Экстракт CHCl3-MeOH (72 г) был получен с MeOH (1 литр x 3 раза) и разделен на MeOH - растворимую фракцию (34.3 г) и MeOH - нерастворимую (37.7 г). Д-маннитол был изолировани из MeOH – нерастворимой фракции(37.7 г). MeOH - растворимая фракция (34.3 г) была успешно выделена с помощью CHCl3 и EtOAc для получения экстракта CHCl3 (6.86 г), экстракта EtOAc (0.16 г) и экстракта H2O (19.2 г), соответственно. Далее, эргостерол (163.2 мг) и бензойная кислота (55.0 мг) были изолированы из экстракта CHCl3 путем многоразового очищения с помощью силикагелевой колоночной хроматографии. MeOH -растворимая часть (60 г) была обработана с n-гексаном (1 литр x 3 раза) для получения n-гексан- растворимой (10.2 г) и n-гексан-нерастворимой фракций (46.1 г). H2O-растворимая фракция и n-гексан- нерастворимая фракция были соединены и противоангиогенные вещества были изолированы из этих фракций под руководством метода анализа ангиогенеза, вызванного Matrigel. H2O-растворимая плюс n-гексан- нерастворимая фракции (выход 65.3 г) были хроматографированы на обращённо-фазовой силан кремнегелевой колонне и элюированы с H2O - MeOH (7:3, в объемном отношении) для получения 20 фракций (М1-М30). Среди этих 20 фракций, фракции М5 и М6 тормозили ангиогенез, вызванный Matrigel. Фракции М5 и М6 (выход 5.54 г) были впоследствии разделены еще на четыре фракции (М5-1 – М5-4) с помощью предварительной обращённо-фазной хроматографии (RP-HPLC)(Shimpack, PREP-ODS, элюат: H2O - MeOH (5:1, в объемном отношении); скорость потока: 6 мл/мин). М5-1 и М5-2 тормозили ангиогенез, вызванный Matrigel. М5-1 и М5-2 (выработка 2.52 г), у которых была нингидрин - положительная реакция, были очищены подготовительной ТСХ (силикагель 60 PF 254, движение растворителя: H2O - MeOH (1:100, в объемном отношении) для получения пяти веществ, включая А-1 (выход 293.7 мг) и А-2 (123.0 мг). Среди этих пяти веществ три были идентифицированы как аланин, пролин и гамма- аминомасляная кислота путем прямого сравнения с аутентичными образцами. Эти три вещества (аланин, пролин и гамма аминомасляная кислота) не оказывали воздействие на ангиогенез, вызванный Matrigel, в то время как А-1 и А-2 тормозили его.

Материалы

Матрица базальной мембраны «Matrigel» (без фактора роста, растворимый экстракт базальной мембраны опухоли Engelbreth- Holm-Swarm (EHS)) была приобретена у Becton Dickinson Labware (Бедфорд, Массачусетс). Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) был приобретен у Nissui Pharmaceutical Co. (Токио) и использовался в качестве среды культивирования. Антибиотические и антигрибковые растворы (100x), содержащие 10000 ед/мл пенициллина, 10мг/мл стрептомицина и 25 µг/мл амфотерицина в 0.9% NaCl, были приобретены у Sigma Co. (St. Louis, Миссури). Фетальная бычья сыворотка (ФБС) была приобретена у GIBCO BRL (Окленд, Новая Зеландия). Сосудистый эндотелиальный фактор роста и гепарин были приобретены у Wako Pure Chemical Co. (Осака, Япония). Средство разделения лимфоцитов мышей (Lympholytes-Mouse) было приобретено у Dainippon Pharmacy Co. (Осака, Япония). Флюоресцеин изотиоцианат (FITC) - меченые противо-мышиные антитела CD4 и CD8, фикоэритрин (ФЕ(FE)) - меченое противо-мышиное природное антитело-киллер (ПК), флюоресцеин изотиоцианат - меченый противо -мышиный IgG2a и ФЕ - меченый противо-мышиный IgG2a были приобретены у Serotec (Оксфорд, Англия). Кроличье поликлональное антитело GM1, мышечный моноклональное противо-человеческое CD8 антитело (D-9) и были приобретены у Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Санта Круз, Калифорния) и DAKO Cytomation (Киото, Япония) соответственно. Набор для определения апоптоза apoptosis in situ был приобретен у Wako Pure Chemical Co.

Клетки

Лекарственно-устойчивые клеточные линии мышей, носителей КЛЛ с большим количеством метастаз, были приобретены в банке генов Riken (Tsukuba, Япония) и содержались в среде культивирования DMEM, в которую была добавлена 10% ФБС , пенициллин (100ед/мл), стрептомицин (10µг/мл) и амфотерицин В (0.25µг/мл).

Животные

Мыши C57BL/6J женского пола (в возрасте 5 недель) были приобретены у Clea Japan Co (Осака, Япония) и содержались в течении 1 недели в комнате с контролируемой температурой и влажностью. До эксперимента они имели свободный доступ к еде и воде. С мышами обращались согласно этическим принципами Мышиного Центра, Медицинского Университета, Университета Ehime. Комитет по Исследованиям на Животных Университета Ehime одобрил протокол эксперимента.

Измерение реваскуляризации, вызванной Matrigel.

Реваскуляризация, вызванная Matrigel, была проанализирована с помощью модификации метода Passaniti et al.8) Вкратце, каждой из мышей C57BL/6J женского пола подкожно была введена инъекция 0.5 мл Matrigel, содержащего 20 нг/мл сосудистого эндотелиального фактора роста и 32 ед/мл гепарина в присутствии или отсутствии указанного количества различных фракций или веществ, изолированных из Agaricus Blazei. Мыши были умерщвлены, а гели извлечены и взвешены, количество гемоглобина в гелях было определено с помощью Hemoglobin kit (Wako Pure Chemical Co.).

Измерение роста опухоли или легочных метастазов у мышей, носителей КЛЛ

КЛЛ (3105 клеток, 0.5 мл) была приготовлена путем трансплантации в спину или внутривенной инъекции мышам C57BL/6J женского пола в нулевой день. Метанол -растворимая фракция (300 или 900 мг на кг массы тела) экстракта CHCl3-MeOH или вещество А-1 (30,100 и 300 мг на кг), изолированное из Agaricus Blazei, принималось орально ежедневно (0700 ч) на протяжении 30 или 14 дней, начиная через 12 часов после имплантации клеток КЛЛ. Метанол-растворимая фракция и А-1 были растворены в дистиллированной воде. Здоровые мыши и мыши, носители КЛЛ, не проходящие лечение, (контрольная группа) принимали дистиллированную воду по тому же графику. Содержание А-1 составляло от 10 до 20% в горячем водном экстракте Agaricus Blazei. Людям горячий экстракт Agaricus Blazei обычно прописывается в дозировке от 3 до 5 грамм три раза в день. По этой причине в исследовании использовались дозировки 30,100 и 300 мг/кг. Объем опухоли измерялся каждые 2-3 дня посредством прямого измерения циркулем. Он рассчитывался как длина*ширину2/ 2. На 31 или 15 день мыши были умерщвлены путем цервикального смещения, а их селезенки, зобные железы и легкие были изъяты и взвешены. Метастазы в легких были подсчитаны с помощью стереомикроскопа. Все опухоли и метастатические легочные ткани были выдержаны в 10% буферном формалине, по меньшей мере, в течение 24 часов.

Иммуногистохимическое исследование опухоли

Ткани опухоли, выдержанные в 10% буферном формалине были постепенно обезвожены в растворах, содержащих повышенное процентное содержание этанола (70, 80, 95 и 100%), очищены в Histoclear (FUME HOOD, AS-ONE, Токио, Япония), залиты парафином под вакуумом, поделены на кусочки толщиной 5мм, депарафинированы и пропитаны гематоксилином и эозином. Количество апоптических клеток в депарафинированных частях опухоли было определено с помощью метода in situ

nick-end labeling (TUNEL), с использованием набора для определения Apoptosis in situ Detection kit. Рост эндотелия (реваскуляризация, вызванная опухолью) и инвазия Т-клеток CD8 и природных клеток-киллеров в опухолях были также определены с помощью техники иммунопероксидазы, с использованием не свойственных человеку антител vWF для обнаружения сосудистых эндотелиальных клеток, антител анти- CD8 и антител анти- асиало GM1 для обнаружения природных клеток-киллеров. Было сфотографировано четыре различных микроскопических поля (усиление x100 или x 400) на тарелке, были подсчитаны TUNEL-положительные апоптические клетки, CD8- и ПКК -положительные клетки в опухолях.

Структура А-1

А-1 – это бесцветное густое вещество с положительной -нингидрин реакцией. Обработка А-1 50% HCl дала L- глютаминовую кислоту. FAB-MS (m/z): 128.0379 (M–1) C5H7O3N. 1H-NMR (в D2O, ppm): 2.08 (1H, dddd, J=12.9, 8.9, 7.1 и 5.7 герц), 2.39 (1H, ddd, J=17.4, 9.3 и 7.1 герц), 2.43 (1H, ddd, J=17.4, 8.9 и 6.7 герц), 2.53 (1H, dddd, J=12.9, 9.3, 9.2 и 6.7 герц), 4.24 (1H, dd, J=5.7 и 9.2 герц). 13C-NMR (в D2O, ppm): 184.35 (-CO-), 181.90 (-COO-), 60.28 (-CH-), 27.64 (-O=C-CH2-), 26.72 (-CH2-H2-).

Статистический анализ

Все величины выражены ±SE. Данные были проанализированы при помощи одностороннего анализа вариантов, впоследствии различия между величинами были проанализированы с помощью Fisher’s protected LSD multiple- comparison test (теста множественного сравнения). Различия считались значительными при P <0.05.

Результаты

Воздействие метанол-растворимой фракции, приготовленной из хлороформ-метанолового (1:1) экстракта Agaricus Blazei на вес опухоли и метастазирование легких у мышей, носителей КЛЛ.

Как видно из таблицы 1, по сравнению с весом опухолей у мышей, носителей КЛЛ, не проходящих курс лечения (контрольные группы), у мышей, носителей КЛЛ и проходящих курс лечения, конечный вес опухоли значительно уменьшился после орального приема метанол-растворимой фракции (300 или 900 мг/кг) в течение 30 дней подряд. Данная фракция была приготовлена из экстракта хлороформ-метанола (1:1). Более того, благодаря оральному приему метанол-растворимой фракции, притормозилось образование опухолевых метастаз в легких.

Таблица 1. Воздействие метанол-растворимой фракции, приготовленной из хлороформ - метанолового (1:1) экстракта Agaricus Blazei на вес опухоли и метастазирование легких у мышей, носителей КЛЛ.

Метанол-растворимая фракция (300 или 900 мг/кг) принималась орально мышами, носителями КЛЛ, ежедневно в течение 30 дней. Величины выражены ± SE у 8 мышей. * P<0.05, значительно отличается от мышей, носителей КЛЛ (контрольная группа).

Воздействие активных веществ (А-1 и А-2), оказываемое на ангиогенез, вызванный Matrigel

Гели, сформировавшиеся после подкожной имплантации Matrigel, были легко отличимы от окружающих тканей и оказывали небольшую местную или ангиогенную реакцию (рис. 1). Гели, произведенные из Matrigel, в которые было добавлено 20 нг/мл сосудистого эндотелиального фактора роста и 32 ед/мл гепарина, вызывали ангиогенную реакцию (рис. 1). Использование смеси Matrigel/ сосудистый эндотелиальный фактор роста /гепарин значительно увеличивало вес геля и концентрацию в нем гемоглобина в сравнении с тем, когда Matrigel вводился самостоятельно на 6 день после имплантации. Метанол-растворимая фракция (800µг/мл), приготовленная из хлороформ-метаноло-растворимой фракции, значительно тормозила ангиогенез, вызванный смесью Matrigel/сосудистый эндотелиальный фактор роста /гепарин (таблица 2). Более того, изоляция активных компонентов из фракций М5 плюс М6 была проведена под руководством анализа Matrigel -имплантированного ангиогенеза, описанного в «Веществах и Методах», а четыре фракции (М5-1 – М5-4), обладающие противоангиогенным воздействием были получены из фракций М5 плюс М6 с помощью предварительной обращённо-фазной хроматографии, как описано в «Веществах и Методах». Среди этих четырех фракций, М5-1 и М5-2 тормозили ангиогенез, вызванный смесью Matrigel /сосудистый эндотелиальный фактор роста /гепарин (таблица 3). А-1 и А-2 были изолированы как противоангиогенные вещества из фракций М5-1 и М5-2 путем повторяющейся ТСХ, описанного в «Веществах и Методах» (таблица 3). А-1 в дозировке 400 или 800 µг/мл тормозил ангиогенез, вызванный Matrigel, пополненным сосудистым эндотелиальным фактором роста и гепарином.

Рис. 1. Противоангиогенное воздействие А-1, изолированного из метанол–растворимой фракции A. blazei. a) и b) Воздействие A-1 на вес Matrigel (a) и концентрацию гемоглобина (b) гелей, вызванных Matrigel пополненного сосудистым эндотелиальным фактором роста и гепарином. Величины выражены±SE у 6 мышей в каждой группе c) Фотографии Matrigel через 6 дней после подкожного введения Matrigel самостоятельно или Matrigel, пополненного сосудистым эндотелиальным фактором роста и гепарином.

В отсутствии или присутствии указанного количества A-1.

Таблица 2. Воздействие активных веществ из A. blazei. на ангиогенез, вызванный Matrigel (1)

Структура активных веществ(а) (А1 и А2).

А-1 и А-2, обладающие противоангиогенным воздействием, были изолированы из метанол-растворимой фракции экстракта хлороформ-метанола (1:1). А-1 – это густое вещество, дающее положительную нингидрин реакцию. Обработка А-1 50% HCl давала L- глютаминовую кислоту. Основываясь на анализе спектра FAB-MS, молекулярная формула А-1 – C5H7O3N (M–1, 128.0379). Спектр 1H-NMR (в D2O, ppm) А-1 показывал протонные, соответствующие метиленовым группам при 2.08 (1H, dddd, J=12.9, 8.9, 7.1 и 5.7 герц) и 2.53 (1H, dddd, J=12.9, 9.3, 9.2 и 6.7 герц) при позиции C-4, и 2.39 (1H, ddd, J=17.4, 9.3 и 7.1 герц) и 2.43 (1H, ddd, J=17.4, 8.9 и 6.7 герц) при позиции C-3, и сигнал, соответствующий метиной группе при 4.24 (1H, dd, J=5.2 и 9.7 герц) при позиции C-5. Спектр 13C-NMR (в D2O, ppm) А-1 показывал углеродные сигналы в результате карбонильных групп при 181.90 и 184.35, сигнал в результате метин группы при 60.28 и сигналы в результате метилен групп при 26.72 и 27.64. Несмотря на то, что эти данные по А-1 схожи с данными по L-пироглютамату, химические сдвиги у А-1 отличался от химических сдвигов у L-пироглютамата. Поэтому можно предположить, что А-1 – это соль натрия или калия пироглютамата. Атомно-абсорбционный анализ А-1 выявил наличие натрия, но другие металлы не были обнаружены. Поэтому, основываясь на атомно-абсорбционный анализе А-1, был сделан вывод, что А-1 – это натриевый пироглютамат. Структура А-2 все еще исследуется.

Воздействие А-1, выделенного из Agaricus Blazei, на рост опухоли и метастазирование легких у мышей, носителей КЛЛ.

По сравнению с объемом опухоли у мышей, носителей КЛЛ, не проходивших курс лечения (контрольная группа), объем опухоли у мышей, носителей КЛЛ, проходивших курс лечения, значительно уменьшился вследствие орального приема А-1 (30,100 и 300 мг/кг) в течение 30 дней подряд (рис. 2). Более того, конечный вес опухоли и образование опухолевых метастаз в легких также тормозились благодаря оральному приему А-1 в дозировке 30,100 и 300 мг/кг (таблица 4). Между тремя дозировками А-1 (30,100 и 300 мг/кг) не было значительной разницы. Для исследования противоопухолевого и противометастатического воздействия более маленьких дозировок А-1 необходимы дальнейшие исследования. Количество эритроцитов (506.3±78.4104 клетки/µл, n=8) и концентрация гемоглобина (7.80±1.25 г/100 мл, n=8) у мышей, носителей КЛЛ, были значительно (P=0.010 и P=0.012 соответственно) ниже (799.0±7.4104 эритроцитов/µл и 12.4±0.09 г гемоглобин/100мл), чем у здоровых мышей. Как видно из таблицы 5, оральный прием А-1 (30,100 и 300 мг/кг) значительно тормозил сокращение количества эритроцитов и концентрации гемоглобина у мышей, носителей КЛЛ, не проходивших курс лечения (контрольные группы). С другой стороны, не наблюдалось значительных различий в количестве лейкоцитов у здоровых мышей и у мышей, носителей КЛЛ, проходивших и не проходивших курс лечения А-1.

Рис. 2. Воздействие A-1, выделенного из A. blazei, на рост опухоли у мышей, носителей КЛЛ. A-1 (30, 100 и 300 мг/кг) принимался орально один раз в день мышами с подкожно имплантированной КЛЛ ежедневно в течение 30 дней. Величины выражены ± SE у 8 мышей. * P<0.05, значительно отличается от мышей, носителей КЛЛ , не проходивших курс лечения.

Таблица 3. Воздействие активных веществ из A. blazei на ангиогенез, вызванный Matrigel (2)

Величины выражены ± SE у 5 мышей. * P<0.05, значительно отличается от Matrigel, дополненного СЭФР (20 нг/мл) и гепарином (32 ед/мл)

Таблица 4. Воздействие А-1, выделенного из Agaricus Blazei, на вес опухоли и метастазирование легких у мышей, носителей КЛЛ.

А-1 (30, 100 и 300 мг/кг) принимался орально мышами, носителями КЛЛ, один раз в день в течение 30 дней. Величины выражены ± SE у 8 мышей. * P<0.05, значительно отличается от мышей, носителей КЛЛ (контрольная группа).

Таблица 5. Воздействие А-1, изолированного из Agaricus Blazei, на вес опухоли и метастазирование легких у мышей, носителей КЛЛ.

А-1 (30, 100 и 300 мг/кг) принимался орально мышами, носителями КЛЛ, один раз в день на протяжении 30 дней. Величины выражены ± SE у 6-8 мышей. * P<0.05, значительно отличается от мышей, носителей КЛЛ (контрольная группа).

Таблица 6. Воздействие А-1, выделенного из Agaricus Blazei, на количество лимфоцитов, Т клеток CD4 и CD8 и природных клеток-киллеров в селезенках мышей, носителей КЛЛ.

А-1 (30, 100 и 300 мг/кг) принимался орально мышами, носителями КЛЛ, один раз в день на протяжении 30 дней. Величины выражены ± SE у 6-8 мышей. * P<0.05, значительно отличается от мышей, носителей КЛЛ (контрольная группа).

Воздействие А-1 на селезеночные CD4и CD8 Т-клетки и клетки природные киллеры у мышей, носителей КЛЛ.

Количество лимфоцитов в селезенках у мышей, носителей КЛЛ, сократилось до 1.39±0.165107 клеток с 3.50±0.45107 клеток у здоровых мышей. Количество селезеночных CD4 и CD8 Т-клеток у мышей, носителей КЛЛ, также сократилось до 2.21±0.356106 клеток (мыши контрольной группы), от 6.50±0.897106 клеток (здоровые мыши) CD4 Т-клеток и от 4.54±0.719106 клеток (контрольная группа) до 7.77±1.19106 клеток (здоровые мыши) CD8 Т-клеток. Не наблюдалось значительной разницы между количеством селезеночных природных клеток-киллеров у здоровых мышей и мышей контрольной группы. Как видно из таблицы 6, уменьшение селезеночных лимфоцитов у мышей, носителей КЛЛ значительно тормозилось оральным приемом А-1 в дозировке 30,100 и 300 мг/кг. Уменьшение количества CD4 и CD8 Т-клеток у мышей, носителей КЛЛ, также тормозилось оральным приемом А-1 в дозировке 30 и/или 300 мг/кг. При оральном приеме А-1 в дозировке 100 мг/кг наблюдалась тенденция торможения (P=0.0596)сокращения CD4 Т-клеток. При оральном приеме А-1 в дозировке 30 мг/кг количество клеток природных киллеров увеличилось в сравнении со здоровыми мышами и мышами, носителями КЛЛ, не проходившими курс лечения (таблица 6).

Воздействие А-1 на иммуногистохимию опухолей у мышей, которым была подкожно имплантирована КЛЛ.

На 31 день А-1 (30,100 и 300 мг/кг) увеличивал количество апоптичных клеток в опухолях у мышей, которым была подкожно имплантирована КЛЛ (рис. 3а и таблица 7). У мышей, носителей КЛЛ, не проходивших курс лечения, выражение vWF в опухолях увеличилось (рис. 3bи таблица 7). Эти данные демонстрируют, что реваскуляризация стимулировалась вместе с ростом опухоли. Ангиогенез в опухолях тормозился посредством орального приема А-1 (30,100 и 300 мг/кг) (рис. 3b и таблица 7). CD8 Т- клетки заполонили центральную часть опухолей после орального прием А-1 (30,100 и 300 мг/кг). Природные клетки-киллеры также заполонили центральную часть опухолей после орального прием А-1 (30,100 и 300 мг/кг) (рис. 3,c и d, таблица 7).

Воздействие А-1 на образование метастаз в легких у мышей, которым была внутривенно введена КЛЛ.

Как видно из рисунка 4, А-1 (30,100 и 300 мг/кг) значительно тормозил количество опухолевых колоний, метастазирующих в легкие по сравнению с мышами, которым была внутривенно введена КЛЛ, не проходивших курс лечения.

Таблица 7. Воздействие А-1, выделенного из Agaricus Blazei, на количество апоптичных клеток, выражение фактора vWF (von Willebrand factor) и количество Т- клеток CD8 и ПК опухолей у мышей, носителей КЛЛ.

Вывод

В нашем предыдущем исследовании мы изолировали эргостерол от липидной фракции Agaricus Blazеi, как противоопухолевого вещества, и получили доказательство, что механизм его противоопухолевого воздействия может затрагивать торможение ангиогинеза, вызванного опухолью. Более того, мы предположили, что вещество(ва) с небольшим молекулярным весом в метанол- или водно-растворимой фракции могут обладать противоангиогенным воздействием. В настоящем исследовании мы изолировали два активных вещества (А-1 и А-2) из метанол-растворимой фракции Agaricus Blazei как противоангеогенные вещества под руководством метода анализа ангиогенеза, вызванного Matrigel. Основываясь на анализе 1H- и 13C-NMR, FAB-MS и атомной абсорбции было определено, что А-1 – это натриевый пироглютамат. Механизм противоангиогенного воздействия А-1 еще должен быть исследован. Возможно, он заключается в тормозящем эффекте производства СЕФР в КЛЛ клетках и присоединения СЕФР к сосудистым эндотелиальным клеткам. Следующим шагом было изучение противоопухолевого противометастатического воздействия изолированного А-1 для прояснения затронутых механизмов. А-1 не влияет на синтез ДНК в клетках КЛЛ или на пупочные венные эндотелиальные клетки (HUVECs ) (данные не продемонстрированы). Солидные опухоли вызывают реваскуляризацию и получающийся в результате ангиогенез стимулирует рост опухоли и метастаз. 9–13) В нашем исследовании in vivo мы показали противоопухолевое и противометастатическое воздействие А-1 на мышей, носителей КЛЛ, и его воздействие, тормозящее снижение иммунных функций (сокращение количества селезеночных лимфоцитов, CD4 и CD8 Т-клеток) на мышей, носителей КЛЛ. Кроме того, А-1 увеличил количество природных клеток-киллеров у мышей, носителей КЛЛ. Иммуногистохимия опухолей после орального применения А-1 выявила, что А-1 увеличил апоптоз клеток опухоли и инвазию CD8 Т-клеток и природных клеток-киллеров в центральную область опухолей. Более того, мы подтвердили, что А-1 тормозил выражение vWF в опухолях (реваскуляризация, вызванная опухолью). Таким образом, у мышей, носителей опухоли, было обнаружено, что А-1 (натриевый пироглютамат) стимулировал специфические иммунные функции в селезенке и опухолях. Было продемонстрировано, что природные клетки-киллеры являются посредником для сильного противоопухолевого и противометастатического воздействия. 14–16). Было выявлено, что и CD4, и CD8 Т- клетки необходимы для побуждения регрессии опухоли и развития защитных функций организма. 17–20). Недавно было объявлено, что интерлейкин (ИЛ)-21 оказывает сильный противоопухолевый эффект посредством активации природных клеток-киллеров и Т-клеток 21). Исходя из полученных результатов можно предположить, что механизм противоопухолевого и противометастатического воздействия А-1 (натриевый пироглютамат) может быть связан с подавлением снижения иммунной реакции, вызванного ростом опухоли и ангиогенезом, вызванным опухолью. Это первый доклад, демонстрирующий, что натриевый пироглютамат (А-1), изолированный из Agaricus Blazei, обладает противоопухолевым и противометастатическим воздействием, явившимся результатом противоангиогенного воздействия и модулирования иммунной системы у мышей, носителей опухоли.

Рис. 4. Воздействие А-1, изолированного из A. blazei на образование метастаз в легких у мышей, которым была внутривенно введена КЛЛ. А-1 (30, 100 и 300 мг/кг) принимался орально мышами, которым была внутривенно введена КЛЛ, один раз в день в течение 14 дней. Величины выражены ± SE у 7 мышей. * P<0.05, значительно отличается от мышей, носителей КЛЛ, не проходивших курс лечения.