Ваш путь по сайту nazdorovye.ru:

Выделение противоопухолевого изолята из Agaricus blazei Murill и механизм его действия1

  1. Такеши Такаку (Takeshi Takaku* );

  2. Ёшиюки Кимура (Yoshiyuki Kimura ,2 );

  3. Хиромичи Окуда (Hiromichi Okuda )

    Второе отделение клинической биохимии, Центральная исследовательская лаборатория медицинского факультета Эхимского университета (Central Research Laboratory, School of Medicine, Ehime University, Shigenobu-cho, Onsen-gun, Ehime 791-0295, Japan).

Базидиальный гриб Agaricus blazei Murill (японское название: химемацутаке или агарикусутаке) традиционно используется в Бразилии в качестве источника здорового питания для профилактики рака, диабета, гиперлипидемии, артериосклероза и хронического гепатита. Сообщалось, что в Японии ежегодно производится 100 000–300 000 кг сушеных плодовых тел A. blazei. Его используют ∼300 000–500 000 человек для профилактики рака и/или в качестве вспомогательного средства при противораковой химиотерапии после удаления злокачественной опухоли. Водный экстракт A.blazei принимают три раза в день, по ∼3-5 г. Горячий водный экстракт A. blazei обладает мощной противоопухолевой активностью в отношении линии мышей-носителей саркомы 180 (1 ,2 ,3 ,4) . Предположительно, противоопухолевой составляющей этого вещества является фракция β-(1-6)-глюкана. Однако противоопухолевое действие липидных фракций не было хорошо изучено. Мы исследовали противоопухолевую активность различных веществ, выделенных из липидной фракции A.blazei , посредством перорального или интраперитонеального введения, для идентификации активных компонентов. Мы впервые выделили эргостерол в качестве противоопухолевого изолята из липидной фракции A.b lazei . Эргостерол содержится в различных грибах, таких как Lentinusedodes (Berk.) Sing. (японское название: шиитаке) и Polyporusumbellatus Fries (японское название: хорей) (5) , и является предшественником эргокальциферола. Мы изучали так же и побочные эффекты этих веществ из A.blazei (например, миелотоксичность, иммунотоксичность и снижение массы тела). Чтобы прояснить механизм противоопухолевой активности активного изолята (эргостерола), мы исследовали его влияние на иммунные функции селезенки и опухоль-индуцированную неоваскуляризацию.

Измерение противоопухолевой активности и побочных эффектов различных фракций и активных изолятов, выделенных из A. blazei, на мышиных линиях с саркомой 180 и карциномой Льюиса (LLC)

Саркома 180 сплошного типа был привита подкожной трансплантацией 1,0 × 106 или 2,5 × 10 6 клеток в правую часть живота мышей, в нулевой день исследования. Различные фракции липидов, такие как экстракт хлороформа/метанола, ацетон-растворимые и нерастворимые фракции и n -гексан-растворимые и нерастворимые фракции, были суспендированы ультразвуком в воде, содержащей 50 г гуммиарабика/л. Эти липидные фракции вводили перорально, в течение 20 последовательных дней, в дозе 800 мг/кг, начиная с 12 ч после имплантации опухолевых клеток. Эргостерол вводили интраперитонеально в дозах 10, 50, 100 или 200 мг/кг или перорально в дозах 100, 200, 400 или 800 мг/кг, в течение 20 последовательных дней. Контрольных мышей кормили NaCl 9 г/л или водой, содержащей только 50 г гуммиарабика/л, по тому же расписанию.

Объем опухоли напрямую измерялся штангенциркулем и вычислялся по формуле [длина (мм) х ширина (мм 2 )] / 2 каждые 2-3 дня. На 21-й день мышам давали диэтиловый эфирный наркоз, брали кровь из вены, затем извлекали опухоль, эпидидимальную жировую ткань, селезенку и тимус, которые взвешивали для оценки противоопухолевой активности и побочных эффектов. Образцы крови собирали в охлажденные пробирки с гепарином. Количество лейкоцитов определяли счетчиком Культера (производитель Japan Scientific Instruments Ltd., Токио, Япония).

Клетки LLC сплошного типа также были трансплантированы подкожно, по 5×10 5 клеток (1 мл) в правую часть брюшной полости мышей, в нулевой день исследования. Эргостерол (50, 200 или 800 мг/кг) вводили перорально раз в день в течение 24-х последовательных дней, начиная с 12 ч после имплантации опухолевых клеток. Контрольным мышам вводили только дистиллированную воду по той же схеме. На 25 день мышей забивали методом цервикальной дислокации, их селезенку, тимус и легкие быстро извлекали и взвешивали.

Измерение числа лимфоцитов и Т-клеточной популяции (CD4+,CD8+иNK1.1+T-клетки) уLLC-мышей линииC57BL/6

Клетки селезенки были аккуратно высвобождены препаровальной иглой, в холодном ФБР. Клеточную суспензию (5 мл) наносили на 5 мл Lympholytes-Mouse и центрифугировали при 1500× g в течение 30 мин. Группа лимфоцитов на поверхности была восстановлена, клетки три раза промыты ФСБ (рН 7,4). Количество лимфоцитов измерено счетчиком Культера. Концентрацию клеток доводили до 2×10 10 клеток/л; затем 10 мкл ФИТЦ-меченных антимышиных CD8, ФИТЦ-меченных антимышиных СD4 или фикоэритрин-меченных антимышиных NK1.1 добавляли к 100 мкл клеточной суспензии. После инкубации в течение 30 мин. при 4 °C, лимфоциты промыли три раза с 1 мл ФСБ и центрифугировали при 700× g в течение 5 минут. Затем СD4+, СD8+ и NK1.1+ Т-клеточные популяции проанализировали в проточном цитофлуориметре FACS Calibur (производитель Becton Dickinson, Маунтин-Вью, Калифорния).

Измерение неоваскуляризации, индуцированной опухолевыми клетками

Опухоль-индуцированная неоваскуляризация определялись in vivo методом дорсального альвеолярного мешка. Краткое описание метода: 1,5 × 106 культивированных LLC- клеток суспендировали в среду DMEM, упаковали в круглую капсулу из нитроцеллюлозной мембраны диаметром 14 мм и имплантировали в дорсальный альвеолярный мешок мышей в нулевой день исследования. Эргостерол (5, 10 или 20 мг/кг) вводили один раз в день на 1-5 день. Мышей забивали на шестой день. Шерсть на коже в месте контакта с мембранной капсулой тщательно сбривалась. Образование новых кровеносных сосудов в подкожной области сфотографировали.

Измерение матригель-индуцированной неоваскуляризации

Matrigel-индуцированная неоваскуляризация определялись in vivo по методу Пассанити (Passaniti) et al. (6) Краткое описание метода: самкам мышей линии c57bl/6 подкожно вводили 0,5 мл матригеля (Matrigel), содержащего 1 мг кислотного фактора роста фибробластов (aFGF) и 64×10 3 ед. гепарина на л, в присутствии или в отсутствии эргостерола (400 или 800 мг/л). Мышей забивали на пятый день повышенной дозой пентобарбитала; гели были снимали и взвешивали. Затем содержание гемоглобина в гелях определяли с помощью тест-наборов Hemoglobin-Test (производитель Wako Pure Chemical, Осака, Япония).

Статистический анализ данных

Все значения выражены через средние ± стандартная ошибка среднего. Данные были оценены в однофакторном дисперсионном анализе ANOVA, затем различия между группами проанализировали в тесте Даннета или защищенном LSD тесте Фишера (критерий множественного сравнения) (существенно отличаются при P < 0,05).

Структура выделенного вещества

Выделенное вещество образовывало бесцветные иглы с температурой плавления 157 °C. В условиях концентрированной H2 SO 4 и CH 3 COOH вещество было красновато-фиолетовым [масс-спектрометрия с бомбардировкой ускоренными атомами m/z 489 (M + H+ )]. Изолят идентифицировали как эргостерол путем прямого сравнения спектральных данных 1 H NMR с аутентичным образцом. Выход составил ∼1,5 г/кг сухого вещества A.blazei.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Противоопухолевое воздействие и побочные эффекты липидных фракций, полученных из A.blazei, в мышиной модели саркомы 180

Хлороформ-метаноловый экстракт (800 мг/кг х 20 г) сильно ингибировал рост опухоли (таблица 1 ). Пероральное введение ацетон-растворимой фракции, выделенной из хлороформ-метанолового экстракта, значительно ингибировало рост опухоли, при дозе 800 мг/кг, в течение 20 дневного лечения. С другой стороны, на рост опухоли не влияло пероральное введение нерастворимой в ацетоне фракции, на 20-й день. Поэтому, ацетон-растворимые фракции с более высокой противоопухолевой активностью были разделены на две фракции путем обработки n-гексаном. N-гексан–растворимые и нерастворимые фракции (800 мг/кг х 20 г) также ингибируют рост опухоли; ингибиторные коэффициенты 80,2 и 90,1 %, соответственно.

ТАБЛИЦА 1

Влияние различных липидных фракций хлороформ-метанолового экстракта (1:1, об./об.), ацетон-растворимых и нерастворимых фракций иn-гексан–растворимых и нерастворимых фракций на объем опухоли на 20-й день исследования и вес опухоли на 21-й день исследования, у мышей-носителей саркомы 1801

Пероральное введение хлороформ-метанолового экстракта и различных фракций, полученных из этого хлороформ-метанолового экстракта не оказывали влияния на прием пищи и увеличением массы тела мышей-носителей саркомы 180, за 20 последовательных дней наблюдения (данные не представлены).

Противоопухолевое воздействие и побочные эффекты эргостерола в мышиных моделях саркомы 180 и LLC

Пероральное введение эргостерола в течение 20-и дней сокращает объем опухоли (рис. 1 ). Коэффициенты ингибирования роста опухоли при пероральном введении эргостерола в дозах 100, 200, 400 и 800 мг/кг × 20 D составили 0,0 ± 30,6; 62,3 ± 8,8; 70,9 ± 10,8 и 85,5 ± 4,7 %, соответственно. Интраперитонеальные инъекции эргостерола так же ингибируют рост опухоли, при дозах 10, 50, 100 и 200 мг/кг, с коэффициентами ингибирования 20,6 ± 20,5; 57,1 ± 6,5; 65,8 ± 4,7 и 84,7 ± 4,2 %, соответственно, за 20 дней наблюдения.

РИСУНОК 1

Влияние перорального введения эргостерина, выделенного из Agaricusblazei, на объем опухоли у мышей-носителей саркомы 180, за 20 дней наблюдения. Клеточная культура саркомы 180 сплошного типа была трансплантирована подкожно в объеме 2,5×10 6 клеток, в правую часть живота мышей, на нулевом дне эксперимента. Указанные объемы эргостерола вводили перорально в течение 20 последовательных дней, начиная с 12 ч после имплантации опухолевых клеток. Контрольным мышам давали воду, содержащую только 50 г гуммиарабика/л, по тому же расписанию. Объем опухоли определяли путем прямого измерения штангенциркулем и вычисляли по формуле [длина (мм) × ширина (мм 2 )/2] каждые 2-3 суток. Все значения выражены через средние ± стандартная ошибка среднего, n = 10, Результаты для временных точек с не разделенным символом, статистически значимо отличаются, P < 0,05.

Sarcoma 180-bearing mice (Control)

Мыши-носители саркомы 189 (контроль)

Ergosterol (100mg/kg)

Эргостерол (100 мг/кг)

Ergosterol (200mg/kg)

Эргостерол (200 мг/кг)

Ergosterol (400mg/kg)

Эргостерол (400 мг/кг)

Ergosterol (800mg/kg)

Эргостерол (800 мг/кг)

Tumor volume (mm 3 )

Объем опухоли (в мм 3 )

Days after inoculation

Дни после инокуляции

Вес опухолей значительно сокращался как при интраперитонеальном, так и при пероральном введении эргостерола (таблица 2 ). Ни пероральное, ни интраперитонеальное введение эргостерина не вызвало побочных эффектов, таких как снижение массы тела или эпидидимальной жировой ткани, миелотоксичность (сокращение числа лейкоцитов) или иммунотоксичность (снижение веса тимуса и селезенки) (данные не показаны). У LLC-мышей эргостерол сокращал конечный вес опухоли и рост опухоли только при дозе 800 мг/кг, на 20-23 день опыта (данные не представлены).

ТАБЛИЦА 2

Влияние интраперитонеального (И/П) и орального введения эргостерола на вес опухоли, на 21-й день эксперимента, у мышей-носителей саркомы 1801, 2

Влияние эргостерола на иммунную функцию и метастазы в легких уLLC-мышей и на цитотоксичность в отношении клеток саркомы 180 иLLC

Эргостерол не оказывал влияния на число лимфоцитов селезенки и СD4+, СD8+ или NK1.1+ Т-клеток (данные не представлены). Число клеточных колоний в легких LLC-мышей (контроль) составляло 4,80 ± 1,24×10 6 . Пероральное введение эргостерола не влияло на метастазы в легких, при дозах 50, 200 и 800 мг/кг в течение 23-х дней наблюдения, при численности опухолевых колонии (×10 6 ) на 3,80 ± 1,62, 4,00 ± 0,58 и 5,33 ± 0,67, соответственно. Эргостерол не показал цитотоксичность в отношении клеток саркомы 180 и LLC клеток (данные не представлены).

Влияние эргостерола наLLC-индуцированную неоваскуляризацию

На пятый день после имплантации LLC-клеток, инкапсулированных в нитроцеллюлозную мембрану, неоваскуляризация была отмечена в области контакта с капсулой, содержащей LLC-клетки. Интраперитонеальное введение эргостерола (20 мг/кг) предотвращало неоваскуляризацию, индуцированную LLC-клетками (рис. 2 ).

 

Normal

Норма

LLC-induced Angiogenesis (Control)

LLC-индуцированный ангиогенез (контроль)

+ Ergosterol (5mg/kg)

+ эргостерол (5 мг/кг)

+ Ergosterol (10mg/kg)

+ эргостерол (10 мг/кг)

+ Ergosterol (20mg/kg)

+ эргостерол (20 мг/кг)

 РИСУНОК 2

Влияние эргостерола на неоваскуляризацию у мышей линии c57bl/6 несущих инкапсулированные LLC-клетки. Капсулы с клетками карциномы легких Льюиса (LLC) подкожно имплантировали в спинной альвеолярный мешок мышей линии c57bl/6, в нулевой день эксперимента. Модифицированная по способу Дульбекко моносреда Игла (норма, А ), инкапсулированные LLC-клетки (контроль, B ) или 5 (С ), 10 (D ) или 20 (Е ) мг эргостерола на кг, введены интраперитонеально с 1-го по 5-й дни эксперимента. Мышей забивали на шестой день, шерсть на коже в зоне контакта с капсулой тщательно сбривалась. Образование новых кровеносных сосудов в подкожной области было сфотографировано.

Влияние эргостерола наMatrigel-индуцированную неоваскуляризацию

Гели, сформировавшиеся после подкожной имплантации монопрепарата Matrigel, были легко отличимы от окружающих тканей. Они давали слабую местную реакцию либо вообще не давали реакции или ангиогенного ответа (рис. 3A ). Однако Matrigel, дополненный 1 мг aFGF и 64 000 ед. гепарина на литр, давал гели, показавшие ангиогенные реакции (рис. 3B ). Смесь Matrigel/aFGF/гепарин значительно увеличивала вес геля и содержание гемоглобина в гелях на шестой день после имплантации, по сравнению с мышами, которых обрабатывали только Matrigel (таблица 3 ). Эргостерол (400 и 800 мг/л) ингибировал увеличение веса и концентрацию гемоглобина в гелях (рис. 3 ,таблица 3 ).

 РИСУНОК 3

Фотографии геля Matrigel через 5 дней после подкожной инъекции 0,5 мл монопрепарата Matrigel (А ), Matrigel с добавлением 1 мг/л, кислотного фактора роста фибробластов и 64 000 ед./л гепарина (B ) или смесь Matrigel/кислотный фактор роста фибробластов/гепарин при дозе 400 (С ) или 800 (D ) мг/л.

Matrigel alone

Моносреда Matrigel

Matrigel /a FGF (1 ng/ml) /Heparin (64 unit/ml)

Matrigel / кФРФ (1 нг/мл) /Heparin (64 ед./мл)

Matrigel/a FGF/Heparin + Ergosterol (400 µg/ml) (800µg/ml)

Matrigel/ кФРФ /гепарин + эргостерол (400 мкг/мл) (800 мкг/мл)

ТАБЛИЦА 3

Влияние эргостерола на вес и содержание гемоглобина в гелях через 5 дней после имплантации мышам матригеля, дополненного кислотным фактором роста фибробластов (aFGF) и гепарином1, 2

ОБСУЖДЕНИЕ

A. blazei применяют ∼300 000–500 000 человек для профилактики рака и/или в качестве вспомогательного средства при раковой химиотерапии после удаления злокачественной опухоли. В ряде публикаций сообщается о противоопухолевой активности различных представителей Basidiomycetes в отношении мышей-носителей саркомы 180, Чихара (Chihara) (7) сообщает о проведении исследования, в котором противоопухолевая активности оценивалась после интраперитонеального введения водных экстрактов из различных Basidiomycetes. Мидзуно (Mizuno) et al. (1) также оценивали противоопухолевую активность на мышах-носителях саркомы 180, при интраперитонеальном введении водного экстракта A. blazei . Недавно, Ито (Ito) et al. (8) сообщили, что интраперитонеальное или пероральное введение полисахаридно-белкового комплекса A. blazei показало противоопухолевую активность в отношении линии мышей с перевитой опухолью.

Однако противоопухолевое действие липидных фракций пока не выяснено. В настоящем исследовании, мы обнаружили, что липидная фракция и фракция β-глюкана тормозят рост опухоли. Мы выделили противоопухолевый изолят эргостерола из липидной фракции, методом многократной колоночной хроматографии с силикагелем.

Так же, мы нашли несколько соединений в дополнение к эргостеролу. Исследования изолятов неизвестных соединений выполняется с целью определения их структуры и изучения их влияния на рост опухоли. Внутрибрюшинное и пероральное введение эргостерина ингибирует рост опухоли, не вызывая каких-либо побочных эффектов, обычно возникающих на фоне противораковых химиотерапевтических препаратов. Эргостерол не оказывал цитотоксического действия в отношении клеток саркомы 180 (данные не представлены). Эргостерол является предшественником эргокальциферола.

Сообщалось, что холекальциферол ингибирует ангиогенез (9 ,10 ,11) . Метаболит эргостерола эргокальциферол также может ингибировать ангиогенез. Поэтому, чтобы уточнить механизм противоопухолевого действия эргостерола, мы изучили влияние эргостерола на опухоль-индуцированные неоваскуляризации.

Индуцированная инкапсулированными LLC-клетками неоваскуляризация тормозилось внутрибрюшинным введением эргостерола в дозах 5, 10 и 20 мг/кг, в течение 5-и последовательных дней эксперимента.

Это открытие позволяет предположить, что либо эргостерол, либо его метаболиты (например, эргокальциферол) могут быть вовлечены в ингибирование опухоль-индуцированной неоваскуляризации. Поэтому мы исследовали ингибирующее влияние эргостерола на матригель-индуцированную неоваскуляризацию, на модели in vivo.

Самкам мышей линии c57bl/6 подкожно вводили Matrigel, содержащий aFGF и гепарин с эргостеролом или без эргостерола. Эргостерол тормозил матригель-индуцированную неоваскуляризацию при концентрациях 400 и 800 мг/л.

Это открытие указывает на то, что эргостерол может напрямую ингибировать матригель-индуцированную неоваскуляризацию, и что противоопухолевое действие эргостерола может быть обусловлено прямым ингибированием ангиогенеза, индуцированного сплошными опухолями.

Настоящий доклад является первым сообщением о том, что эргостерол является антиангиогенным веществом.

 

Оригинальный текст статьи >>>

 

 

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить