Ваш путь по сайту nazdorovye.ru:

Таканори Цудзи ( Takanori Tsuji ), Вей Ду ( Wei Du ), Такаши Нишиока ( Takashi Nishioka ), Лихуа Чен ( Lihua Chen ), Дайсукэ Ямамото ( Daisuke Yamamoto ), и Чанг Ян Чен ( Chang Yan Chen )

Обзор

Гриб Phellinus linteus (Санхван) обладает противоопухолевыми свойствами. Ранее мы сообщали, что обработка Санхваном приводит к апоптозу культивированные раковые клетки предстательной железы человека. В ходе дальнейшего изучения механизмов PL-опосредованного апоптоза мы провели анализ ксенотрансплантатов совместно с invitro анализами, чтобы оценить влияние Санхвана на генезис и развитие опухолей, образующихся из перевитых РС3 и DU145 клеток рака простаты. После прививки, голым мышам вводили PL каждые два дня в течение 12 дней. Хотя обработка PL не предотвращала формирование перевитых опухолей, темпы их роста после такой обработки резко ослаблялись. Далее мы проверили влияние Санхвана на опухоли через двенадцать дней после инокуляции. Когда перевитые опухоли достигали определенного размера, мышам подкожно вводили Санхван. Гистохимические или иммунохимические анализы показали, что апоптоз имел место при активации каспазы-3 в опухолях, сформированных прививкой клеток DU145 или PC3 рака предстательной железы. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными в культурах этих клеток. Таким образом, наше исследование in vivo показывает, что Санхван способен не только ослаблять рост опухоли, но и вызвать ее регрессию путем индуцирования апоптоза.

Введение

Рак предстательной железы опустошителен для мужчин. Хотя лечение (хирургия или андрогенная абляция) повышает рейтинг выживаемости пациентов, однако, проблема отсутствия успеха при гормонорефрактерном раке предстательной железы остается. Прогрессирующие опухоли часто устойчивы к химиотерапевтическим препаратам. Хотя механизмы резистентности неясны, постулируется, что развитие опухолей типа рефрактерного рака простаты связано с накоплением генетических или эпигенетических альтераций. В Азии Санхван относят к числу хорошо зарекомендовавших себя лекарственных грибов, применяемых для лечения различных злокачественных новообразований человека. Исследования указывают на биологическую активность водорастворимой фракции Санхвана, что вероятно обусловлено полисахаридами. Также показано, что Санхван способен подавлять опухоли in vitro, либо косвенно активируя иммунную систему хозяина, либо напрямую индуцируя апоптоз в опухолевых клетках. Недавно мы сообщили об удивительной эффективности Санхвана в плане ингибирования роста различных клеточных линий рака предстательной железы без токсического воздействия на нормальные клетки этого органа. В Азии противоопухолевые, анти-ангиогенные и иммуномодулирующие свойства Санхвана вызвали к нему широкий интерес, направленный на развитие противораковой терапии на его основе. Для выработки из этого целебного гриба лекарственного средства против рака предстательной железы требуется лучшее понимание молекулярных механизмов, составляющих основу свойств Санхвана.

Потенциал препарата в плане индуцирования апоптоза широко применяется в стратегии разработки новой терапии против рака. Известно, что апоптоз может быть спровоцирован различными внутренними или внешними сигналами. Каспазы, высококонсервативное семейство цистеиновых протеаз, относятся к ключевым эффекторам апоптоза в клетках и играют важную роль в его регуляции через цепные реакции расщепления. Каспазы присутствуют в форме проэнзимов в цитозоле клеток и активируются через протеолиз. При стимуляциях клеточной смерти, каспаза 8, как инициатор, провоцирует активацию нижестоящих эффекторных каспаз 3 и 7, в результате чего происходит расщепление BID и высвобождение цитохрома C. Высвобождение цитохрома C из митохондрий в цитозоль вызывает формирование апоптосомного комплекса, который в свою очередь провоцирует внутренние апоптотические механизмы. Показано, что путем активации каспазного каскада, Санхван провоцирует прохождение апоптоза раковыми клетками простаты. Кроме того, низкие дозы доксорубицина (противоопухолевого препарата) наряду с низкими концентрациями Санхван оказывают синергическое воздействие на индукцию апоптоза в клетках рака предстательной железы человека.

Ранее мы сообщали, что Санхван способен сенсибилизировать культивированные клетки рака предстательной железы к апоптозу на фоне активизации каспаз. Наше настоящее исследование, как продолжение изучения противоопухолевых свойств Санхвана, еще больше демонстрирует способность PL вызывать апоптоз в клетках DU145 или PC3 перевитых опухолей рака простаты, у голых мышей. Показано, что инъекция Санхван резко ослабляет генезис опухолей у голых мышей после инокуляции. Наше исследование также показало, что при инъекциях Санхвана, формирующиеся опухоли у голых мышей, инокулированных клетками DU145 или PC3, прошли регрессию через провоцирование апоптотических процессов.

Результаты

PL аттенюирует формирование опухолей клетками DU145 или PC3 у голых мышей

Согласно исследованиям, Санхван обладает противоопухолевыми свойствами. Показано, что Санхван способен не только инициировать апоптоз в различных линиях клеток рака предстательной железы, но и индуцировать G1 -арест в нормальных эпителиальных клетках простаты. В дальнейших испытаниях противоопухолевого воздействия Санхвана применялся анализ ксенотрансплантатов. После подкожной прививки голых мышей клетками РС3 рака предстательной железы человека, одновременно животным сделали инъекции Санхвана. Затем каждые два дня мышам делали инъекции одинакового количества Санхвана. Через двенадцать дней были сделаны фотографии мышей-носителей опухолей (Рис. 1A , верхняя панель), а микропрепараты опухолевых тканей были окрашены ГЭ (Рис. 1B , нижняя панель). Опухоли у мышей, обработанных Санхваном, были значительно меньше, чем у контрольных и показали четкую структуру окрашивания ГЭ.

 

 

Рисунок 1

Аттенюация опухолей, сформированных из перевитых клеток DU145 или PC3 у голых мышей, после обработки Санхваном.

Через неделю после инокуляции, когда у всех мышей начали проявляться признаки образования плотных опухолевых масс, мы измерили диаметры перевитых опухолей. Измерения проводились каждые четыре дня, в течение 12 дней ( Рис. 1B и C ). На двенадцатый день контрольные опухоли из двух привитых клеточных линий были примерно в два раза больше, чем обработанные Санхваном. Для исключения возможной токсичности со стороны Санхвана, вес ( Рис. 2A ) и потребление воды ( Рис. 2B ) мышами измеряли и сравнивали. Мыши, обработанные PL, имели тот же вес или потребление воды, что и контрольные. Предполагается, что Санхван не оказал побочного эффекта на обработанных или необработанных мышей. В дальнейшем, для проверки токсичности воздействия Санхвана на обработанных мышей, была извлечена печень животных. Гистохимическое окрашивание с ГЭ красителем показало, что структуры печени Санхван -обработанных мышей были схожи с полученными от контрольных мышей (данные не представлены). В обоих случаях печень была здоровой без каких-либо признаков дегенерации, фиброза, апоптоза или некроза. Данное исследование in vivo показывает, что Санхван способен подавлять скорость роста перевитых опухолей у голых мышей.

Обработка Санхваном вызывает регрессию роста опухолей из инокулированных раковых клеток предстательной железы

Рисунок 2

Анализ побочных эффектов Санхвана.

Мы протестировали влияние Санхвана на имеющиеся опухоли. Когда инокулированные опухоли достигали размера 1,0 см в диаметре, мышам делали инъекции Санхвана каждые два дня, в течение десяти дней. Опухоли были извлечены и подготовлены к гистопатологическому или иммуногистохимическому анализу. Окрашивание ГЭ показало, что опухоли полученные от Санхван-обработанных или контрольных мышей были хорошо ограничены соединительной тканью (Рис. 3A ). Смерть клеток имела место в Санхван-обработанных опухолях, перевитых от двух различных линий клеток рака предстательной железы, со многими неокрашенными вакуолями, которые отсутствовали в опухолях контроля. Для дальнейшего выявления присутствия апоптоза в опухолях, обработанных Санхваном, был проведен иммуногистохимический анализ с применением окрашивания методом TUNEL (для выявления разрывов цепочек ДНК) (Рис. 3B ). Микропрепараты из опухолей, обработанных Санхваном, были сильно окрашены в TUNEL-тесте, и лишь немногие TUNEL-положительные окрашенные клетки обнаружены в опухолях контроля. Процентное соотношение TUNEL-положительных окрашенных клеток измерялось для контрольных и Санхван-обработанных опухолей (данные не приведены). Более 30 % клеток в Санхван-обработанных опухолях имели разрыв структуры ДНК, и очень небольшой процент клеток из контрольных опухолей (около 5 %) был положительно окрашен. Для выявления экспрессии каспазы 3 проведено иммуногистохимическое окрашивание с анти-каспаза-3 антителами (Рис. 3C ). Большое количество клеток в Санхван-обработанных опухолях, сформированных путем инокуляции РС3 клеток, реагировали с антителами. Для сравнения, только у нескольких клеток в контрольной опухоли выражен высокий уровень каспазы 3. Аналогичные результаты получены для опухолей, сформированных инокуляцией клеток DU145 (данные не приведены). Результаты указывают на смерть клеток в Санхван-обработанных опухолях через апоптоз.

Рисунок 3

Гистопатологическое или иммуногистохимическое окрашивание Санхван-обработанных или контрольных опухолей, извлеченных из мышей.

В ходе дальнейшей проверки способности Санхвана индуцировать апоптоз, клетки DU145 и PC3 были обработаны 1 мг/мл или 2 мг/мл PL в течение 48 ч. Проведен анализ с аннексином V (Рис. 4 ). Около 15 % Санхван-обработанных клеток прошли апоптоз, с дозозависимым результатом. В контрольных опухолях отмечено исходное окрашивание аннексином V. Интересно, что клетки PC3 были более чувствительны к Санхвану, чем клетки DU145. В целом, данные in vitro соответствуют данным, полученным в ходе экспериментов на животных.

Рисунок 4

Индукция апоптоза в культивированных клетках DU145 и PC3 в ответ на обработку Санхваном .

Обсуждение

Ранее мы демонстрировали, что Санхван индуцирует прохождение апоптоза в культивированных клетках рака предстательной железы. Методом анализа ксенотрансплантатов мы показали, что Санхван может вызывать апоптотический ответ invivo , блокирующий рост опухолей, образованных из перевитых клеток DU145 или РС3 рака предстательной железы человека. Окрашивание в гистохимическом анализе показало, что большинство клеток опухолей, извлеченных из Санхван -обработанных мышей являются апоптотическими. Это проявлено в TUNEL- положительном окрашивании и реакции с анти-каспаза-3 антителами. Присутствие апоптоза также отмечено в культуре клеток DU145 или РС3 после обработки Санхвана в течение 48 часов, с дозозависимым результатом. В нашем исследовании анализы как invivo, так и invitro указывают, что обработка Санхвана инициирует каскад каспаз, вызывающий апоптоз в раковых клетках простаты. Это является веским свидетельством в пользу потенциала Санхвана как противоопухолевого средства при раке предстательной железы.

Известно, что Санхван в целом нетоксичен. Ранее мы сообщали, что Санхван в больших дозах индуцирует в контрольных клетках эпителия легких арест клеточного цикла в G1 -фазе, блокируя экспрессию циклина D1 и его взаимодействие с клеточными циклинзависимыми киназами 4 и 6. В текущем исследовании данные гистопатологического анализа показывают, что инъекция Санхвана голым мышам, инокулированным клетками рака предстательной железы DU145 или PC3, не оказывает токсического воздействия на мышей, поскольку обработка Санхваном никак не сказывается на росте животных или потреблении ими воды. Важно отметить, что образцы печени от обработанных мышей являются нормальными, без дегенерации или фиброза. Возможно, что как и в in vitro экспериментах, обработка Санхваном активирует контрольные точки клеток в нормальных тканях или органах, что не вредно для мышей. В перевитых опухолях такая же обработка представляется очень цитотоксичной.

Запрограммированная гибель клетки - важный механизм исключения аномальных или раковых клеток. Активация элементов семейства каспаз лежит в основе апоптоза и представляет собой точку пересечения различных путей апоптоза в разных типах раковых клеток, включая клетки рака предстательной железы. ФНО или Fas/CD95 рецепторы митохондриальных белков (например, цитохром С) и гранзимы способны индуцировать гибель клеток через активацию каскада каспаз. Показано, что повреждение или стресс в ЭР и аппарате Гольджи способны провоцировать апоптоз. Исследования показали, что за ЭР-зависимый апоптоз отвечает отклик неструктурированных белков или отсутствие кальция. Оказалось, что стресс ЭР вызывает перенос некоторых каспаз в ЭР и Гольджи и осуществление апоптоза в этих структурах. Кальций, высвобождающийся из ЭР при эпизодах дефицита АТФ, является важным элементом апоптоза, индуцированного травмой ишемии/реперфузии. Показано, что обработка Санхваном провоцирует активацию каспаз в культивируемых раковых клетках предстательной железы. Наше invivo исследование показывает, что обработка Санхваном может инициировать апоптоз через активацию каспазы 3, являющейся эффектором каспазной цепной реакции. Исследование возможного участия других каспаз в индукции апоптоза invivo продолжается.

Санхван является одним из хорошо зарекомендовавших себя лекарственных грибов, который употребляли перорально в качестве обычной оздоравливающей пищевой добавки или адъюванта при лечении злокачественных новообразований в Азии в течение многих десятилетий. Экстракт из водорастворимой фракции Санхвана показывает относительно равномерное распределение молекулярного веса при гель-проникающей ВЭЖХ и оценивается примерно в 150-180 кД от срока хранения на молекулярных маркерах пуллулана ВЭЖХ. В качестве главных компонентов Санхвана предложены различные полисахариды. Показано также, что водорастворимая фракция Санхвана способна подавлять опухоли либо косвенно, усиливая иммунную систему хозяина, либо непосредственно индуцируя апоптоз в опухолевых клетках. Однако до сих пор неясно, какие именно комплексы полисахаридов в Санхване обладают противоопухолевым эффектом.

Успешное применение Санхвана в лечении рака предстательной железы требует полного понимания механизмов опосредованного воздействия Санхвана на противоопухолевую активность. Наше предыдущее исследование показало, что через активацию каспаз гриб Санхван способен вызвать апоптоз в культивированных раковых клетках. В представленном исследовании с применением анализа ксенотрансплантатов, мы еще раз продемонстрировали, что инъекции Санхвана голым мышам со сформированными подкожными опухолями от перевитых клеток рака простаты DU145 или РС3, индуцируют потерю жизнеспособности большинством опухолевых клеток. Наши данные in vivo подтверждают, что путем включения механизма подавления опухоли, Санхван может быть доработан до эффективного терапевтического средства лечения злокачественных новообразований человека, таких как рефрактерный рак предстательной железы.

 

Источник https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2847601/

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить

Сохранить